Qu'est-ce que le sulforaphane? | El Paso, TX Docteur en chiropratique
Dr. Alex Jimenez, Chiropraticien d'El Paso
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Sulforaphane est un composé phytochimique, une substance du groupe isothiocyanate de composés organosulfurés, que l'on trouve dans les légumes crucifères, tels que le brocoli, le chou, le chou-fleur et le chou de Bruxelles. On peut également le trouver dans le bok choy, le chou frisé, le chou vert, les feuilles de moutarde et le cresson. Des études ont montré que le sulforaphane peut aider à prévenir divers types de cancer en: activer la production de Nrf2, ou facteur nucléaire érythroïde 2-related factor, un facteur de transcription qui régule les mécanismes antioxydants protecteurs qui contrôlent la réponse de la cellule aux oxydants. Le but de l'article suivant est de décrire la fonction du sulforaphane.

Abstrait

Le système antioxydant KEAP1-Nrf2-ARE est un moyen principal par lequel les cellules répondent aux stress oxydatifs et xénobiotiques. Le sulforaphane (SFN), un isothiocyanate électrophile dérivé de légumes crucifères, active la voie KEAP1-Nrf2-ARE et est devenu une molécule d'intérêt pour le traitement de maladies dans lesquelles le stress oxydatif chronique joue un rôle étiologique majeur. Nous démontrons ici que les mitochondries de cellules épithéliales pigmentées de rétine humaine (RPE-1) en culture, traitées avec du SFN, subissent une hyperfusion indépendante de Nrf2 et de son inhibiteur cytoplasmique KEAP1. Il a été rapporté que la fusion mitochondriale était cytoprotectrice en inhibant la formation de pores dans les mitochondries au cours de l'apoptose. En accord avec cela, nous montrons une cytoprotection indépendante de Nrf2 des cellules traitées au SFN exposées à l'inducteur de l'apoptose, la staurosporine. Mécaniquement, le PNS atténue le recrutement et / ou la rétention du facteur de fission soluble Drp1 dans les mitochondries et les peroxysomes, mais n'affecte pas l'abondance globale de Drp1. Ces données démontrent que les propriétés bénéfiques du SFN s'étendent au-delà de l'activation du système KEAP1-Nrf2-ARE et justifient un interrogatoire supplémentaire, compte tenu de l'utilisation actuelle de cet agent dans plusieurs essais cliniques.

Mots clés: Sulforaphane, Nrf2, Drp1, Mitochondries, Fission, Fusion, Apoptose

Introduction

Sulforaphane est un inhibiteur indépendant de la fission mitochondriale par Nrf2

Le sulforaphane (SFN) est un composé d'isothiocyanate dérivé du régime alimentaire le plus souvent issu de légumes crucifères [56]. Il est généré chez les plantes en tant que réponse xénobiotique à la prédation via la libération vésiculaire de l'enzyme hydrolytique myrosinase à partir de cellules endommagées; cette enzyme convertit les glucosinolates en isothiocyantes [42]. Au cours des deux dernières décennies, le SFN a été largement caractérisé pour ses propriétés anticancéreuses, antioxydantes et antimicrobiennes (57). Une grande partie de cette efficacité a été attribuée à la capacité du SFN à moduler la voie de signalisation de l'ARUS (KEAP1-Nrf2-antioxydant response element), bien que des activités supplémentaires du composé aient été identifiées, notamment l'inhibition de l'activité de l'histone désacétylase et la progression du cycle cellulaire [ 29]. Nrf2 est le principal facteur de transcription des antioxydants et, dans des conditions d'homéostasie, sa stabilité est inhibée par l'action du complexe cytoplasmique d'ubiquitine ligase [3] Cullin1KEAP20. Spécifiquement, Nrf2 est recruté dans la Cullin3KEAP1 ligase en se liant à l'adaptateur de substrat dimère KEAP1 et est ensuite modifié avec des chaînes polyUb qui ciblent le facteur de transcription pour la dégradation induite par le protéasome. Ce changement constitutif limite la demi-vie de Nrf2 dans les cellules non stressées à ~ 15 min [30], [33], [46], [55]. En réponse à de nombreux types de stress, notamment le stress oxydatif, KEAP1, une protéine riche en cystéine, agit comme capteur redox et modifie par oxydation les cystéines critiques, en particulier C151, de KEAP1 dissociant Nrf2-KEAP1 de CUL3, induisant NrfXNXX en inhibant la synthèse. 2], [8], [20]. Notamment, SFN, et éventuellement d'autres activateurs de Nrf55, imitent le stress oxydatif en modifiant C2 de KEAP151, par exemple [1]. La stabilisation de Nrf21 permet sa translocation vers le noyau où elle induit l’expression d’une batterie de gènes de phase II anti-oxydants et détoxifiants. Nrf2 se lie aux éléments promoteurs de la réponse antioxydante (ARE) de ses gènes cibles apparentés par hétérodimérisation avec de petites protéines Maf [2]. Ce système présente une réponse dynamique et sensible aux antioxydants indirects comme le SFN, les radicaux libres générés par la mitochondrie [19] ou d’autres sources physiologiques de stress oxydatif [16].

Les mitochondries sont des organites subcellulaires dynamiques qui régulent une multitude de fonctions cellulaires allant de la production d'ATP à la régulation du calcium intracellulaire à la régulation rédox et à l'apoptose [13], [49]. Les mitochondries représentent également la principale source d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans la cellule. Une régulation adéquate de la fonction mitochondriale est donc nécessaire pour optimiser la production d’ATP afin de répondre aux besoins cellulaires tout en minimisant les effets potentiellement nocifs d’une production excessive de radicaux libres. Une condition essentielle pour une modulation fine de la fonction mitochondriale est la capacité des mitochondries à fonctionner de manière indépendante en tant que machines biochimiques et en tant que partie d’un réseau vaste et réactif.

La morphologie et la fonction du réseau mitochondrial sont déterminées par un équilibre régulé entre la fission et la fusion. La fission mitochondriale est nécessaire pour la transmission des cellules filles par les mitochondries au cours de la division cellulaire [28], ainsi que pour la dégradation sélective, autophagique des mitochondries dépolarisées ou endommagées, appelée mitophagie [1]. À l'inverse, la fusion est nécessaire pour la complémentation des génomes mitochondriaux et le partage des composants de la chaîne de transport d'électrons entre les mitochondries voisines [54]. Au niveau moléculaire, la fission et la fusion mitochondriales sont régulées par de grandes GTPases de type dynamine. Trois enzymes régulent principalement la fusion: les mitofusines 1 et 2 (Mfn1 / 2) sont des protéines de la membrane externe à deux passes qui médient la fusion de la membrane externe via des interactions hétérotypiques entre les mitochondries adjacentes [15], [25], [37], tandis qu'OPA1 est un facteur intérieur. Protéine membranaire assurant simultanément la connectivité de la matrice en régulant la fusion des membranes internes [5]. L'activité GTPase des trois protéines est nécessaire à la fusion robuste [5], [18] et OPA1 est ensuite régulée par une protéolyse complexe au sein de la membrane interne de la mitochondrie par les protéases OMA1 [14], PARL [6] et YME1 ]. Il est important de noter qu'un potentiel de membrane mitochondriale intact est requis pour une fusion efficace afin de supprimer l'intégration des mitochondries endommagées et en santé [45].

La fission mitochondriale est principalement catalysée par une protéine cytosolique appelée protéine liée à la dynamine, 1 (Drp1 / DNM1L). Drp1 est recruté à partir du cytosol dans des sites potentiels de fission sur la membrane externe des mitochondries [43]. Les principaux récepteurs de Drp1 sur la membrane externe sont le facteur de fission mitochondrial (Mff) [32] et, dans une moindre mesure, la Fission 1 (Fis1) [51]. De plus, on a découvert un récepteur leurre, MIEF1 / MiD51, qui agit pour limiter davantage l’activité de la protéine Drp1 au niveau de sites de fission potentiels [58]. Une fois amarré à la membrane externe de la mitochondrie, Drp1 s'oligomérise en structures en spirale autour du corps de la mitochondrie, puis utilise l'énergie dérivée de l'hydrolyse du GTP pour atténuer la scission physique des membranes externe et interne de la mitochondrie [17]. Les tubules dérivés du réticulum endoplasmique agissent comme un constricteur initial des mitochondries avant l’oligomérisation de Drp1, soulignant la révélation que les mitochondries non rétrécies sont plus larges que la circonférence permissive d’un spiral Drp1 [12] complet. La dynamique de l'actine est également importante pour les interactions ER-mitochondries qui précèdent la fission mitochondriale [24]. En plus de son rôle dans la fission mitochondriale, Drp1 catalyse la fission des peroxisomes [40].

Drp1 est très similaire à la protéine dynamine bien caractérisée en ce sens que les deux protéines contiennent un domaine GTPase N-terminal, un domaine Moyen essentiel pour l'auto-oligomérisation et un domaine effecteur GTPase C-terminal [31]. Drp1 obtient la sélectivité pour les membranes mitochondriales grâce à une combinaison d'interactions avec ses protéines réceptrices Mff et Fis1 et également par son affinité pour la cardiolipine phospholipidique spécifique des mitochondries via le domaine d'insertion B unique de Drp1 [2]. Drp1 existe généralement en tant qu'homotétramère dans le cytoplasme, et l'assemblage d'ordre supérieur aux sites de fission mitochondriale est médié par le domaine moyen de Drp1 [3].

Etant donné le lien implicite entre la fonction mitochondriale et la voie KEAP1-Nrf2-ARE, nous avons étudié les effets de l'activation de Nrf2 sur la structure et la fonction mitochondriale. Nous démontrons ici que SFN induit une hyperfusion mitochondriale qui, de manière inattendue, est indépendante à la fois de Nrf2 et de KEAP1. Cet effet du SFN se traduit par une inhibition de la fonction de Drp1. Nous démontrons en outre que le SFN confère une résistance à l'apoptose indépendante de Nrf2 et imite celle observée dans les cellules dépourvues de Drp1. Ces données indiquent collectivement qu’en plus de stabiliser et d’activer Nrf2, le SFN module la dynamique mitochondriale et préserve la condition physique et la survie des cellules.

Resultats

Sulforaphane induit une hyperfusion de M indépendante de Nrf2 / KEAP1Itochondria

Au cours de l'étude des effets de l'activation de Nrf2 sur la dynamique du réseau mitochondrial, nous avons découvert que le traitement des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes immortalisées (RPE-1) humaines avec du sulforaphane (SFN), un puissant activateur de la signalisation Nrf2, induisait une solide fusion de le réseau mitochondrial par rapport aux cellules de contrôle traitées au véhicule (Fig. 1A et B). La morphologie des mitochondries dans ces cellules ressemblait beaucoup à celle des mitochondries dans les cellules appauvries en ARNsi de Drp1 endogène, principal facteur de fission mitochondriale (Fig. 1A). Ce résultat a fait naître l’idée fascinante que la fission mitochondriale et l’état de la fusion répondent directement aux niveaux de Nrf2 dans la cellule. Cependant, la stimulation de cellules avec d'autres stabilisants et activateurs de Nrf2 tels que l'inhibiteur de protéasome MG132, le tBHQ pro-oxydant ou l'inhibition de l'inhibiteur de Nrf2, KEAP1, n'a pas induit de fusion mitochondriale (Fig. 1A et B). La stabilisation de Nrf2 par ces manipulations a été confirmée par Western blot pour le Nrf2 endogène (Fig. 1C). En outre, l'expression de Nrf2 était indispensable pour la fusion mitochondriale induite par le SFN, car l'inactivation de Nrf2 endogène par l'ARNsi ne parvenait pas à contrer ce phénotype (Fig. 1D – F). Parce que SFN stimule la voie KEAP1-Nrf2-ARE en modifiant de manière covalente les résidus de cystéine de KEAP1 [21], nous avons assommé KEAP1 pour déterminer si l'hyperfusion mitochondriale induite par le SFN est stimulée par un facteur Nfx, dépendant de KEAP1. Cependant, l'épuisement de KEAP2 n'a ​​pas non plus réussi à abroger la fusion mitochondriale induite par le SFN (Fig. 1G – I). En fait, le SFN a inversé la morphologie de la fission induite par l’appauvrissement de KEAP1 (Fig. 1G, panneau b par rapport au panneau d). Ces résultats indiquent que le traitement par le SFN provoque une fusion mitochondriale indépendante de la voie canonique KEAP1-Nrf1-ARE et nous a amenés à nous demander si le SFN affecte directement des composants de la machinerie de fission ou de fusion mitochondriale.

La figure 1 SFN induit une fusion mitochondriale indépendante de Nrf2 / KEAP1. (A) Les cellules RPE-1 ont été transfectées avec les siRNA indiqués et 3 jours plus tard traitées avec du DMSO ou les activateurs Nrf2 SFN (50 μM), MG132 (10 μM) ou tBHQ (100 μM) pendant 4 h. Les mitochondries (en rouge) sont marquées avec un anticorps anti-Tom20 et les noyaux (en bleu) sont contre-colorés avec du DAPI. (B) Graphique montrant la quantification de la notation de la morphologie mitochondriale de (A). > 50 cellules par condition ont été évaluées en aveugle. (C) Western blots représentatifs de (A). (D) Les cellules RPE-1 ont été transfectées avec 10 nM d'ARNsi et 3 jours plus tard traitées avec SFN pendant 4 h avant d'être fixées et colorées comme dans (A). (E) Graphique montrant la quantification du score phénotype mitochondrial de (D). > 100 cellules par condition ont été évaluées en aveugle. (F) Western blots représentatifs de (D). (G) Les cellules ont été transfectées et traitées comme dans (D) avec siCON ou siKEAP1. (H) Les cellules de (G) ont été notées comme dans (B) et (E) sur la base de la morphologie mitochondriale. (I) Western blots représentatifs de (G). Les données en (B), (E) et (H) ont été compilées à partir de 3 expériences indépendantes chacune et la signification statistique a été déterminée par le test t bilatéral de Student. Les barres d'erreur reflètent +/- SD (pour l'interprétation des références à la couleur dans cette légende de figure, le lecteur est renvoyé à la version web de cet article).

Sulforaphane altère l’association mitochondriale de Drp1

Sur la base de la découverte que le traitement par le SFN induit une hyperfusion mitochondriale, nous avons considéré que ce phénotype était soit une conséquence d’une activité de fusion excessive, soit une inhibition de l’activité de fission. Pour discriminer ces deux possibilités, nous avons comparé la morphologie des peroxysomes en présence et en absence de SFN. Les peroxisomes ressemblent aux mitochondries en ce qu’ils sont des organites dynamiques dont la forme et la longueur sont en constante évolution [44]. Les peroxysomes contiennent à la fois Fis1 et Mff dans leur membrane externe et, en conséquence, sont des cibles pour la fission médiée par Drp1 [22], [23]. Cependant, les peroxysomes n'utilisent pas la machinerie de fusion du réseau mitochondrial et, par conséquent, ne subissent pas de fusion [39]. La fission des peroxysomes s'oppose à l'allongement des peroxysomes existants via l'addition de novo de membranes et de protéines [44]. Comme les peroxysomes sont dépourvus de Mfn1 / 2 et d'OPA1, nous avons conclu que si le réseau de boîtes aux lettres (SFN) active la machinerie de fusion plutôt que d'inhiber la machinerie de fission, la longueur du peroxysome n'en serait pas affectée. Dans les cellules traitées avec le véhicule, les peroxysomes sont maintenus sous forme d'organites ponctuels courts et ronds (Fig. 2, panneaux b et d). Cependant, le traitement par le SFN augmentait la longueur du peroxysome de ~ 2 par rapport aux cellules contrôles (Fig. 2, panneaux f et h). En outre, de nombreux peroxysomes ont été pincés près du centre, indiquant un défaut de scission potentiel (Fig. 2, panneau h, têtes de flèches). De même, les peroxisomes dans les cellules transfectées avec Drp1 siARN étaient anormalement longs (Fig. 2, panneaux j et l), confirmant que Drp1 était nécessaire à la fission peroxisomal et suggérant que le traitement par le SFN provoquait des phénotypes mitochondriaux et peroxisomaux en perturbant le mécanisme de fission.

La figure 2 SFN induit l’allongement du peroxysome. (A) Des cellules RPE-1 ont été transfectées avec 10 nM de l'ARNsi indiqué et 3 quelques jours plus tard, elles ont été traitées avec du DMSO ou du 50 µM ​​SFN pour 4 h. Les peroxysomes (verts) ont été marqués avec un anticorps anti-PMP70, les mitochondries avec MitoTracker (rouge) et l'ADN contre-colorés avec DAPI. Les incrustations agrandies de peroxysomes sont représentées à droite (panneaux d, h et l) afin de faciliter la visualisation des changements de morphologie induits par l’appauvrissement du SFN et de Drp1. Les pointes de flèche mettent en évidence les points de constriction. (Pour l'interprétation des références à la couleur dans cette légende, le lecteur est invité à consulter la version Web de cet article).

Nous avons ensuite déterminé comment SFN restreignait la fonction Drp1. Les possibilités comprenaient la réduction des niveaux d'expression, le recrutement / la rétention au niveau de la mitochondrie, l'oligomérisation ou l'activité enzymatique de la GTPase. Un déficit de l’un d’eux entraînerait une réduction de la fission mitochondriale et de l’hyperfusion. Nous n'avons pas détecté de modifications reproductibles du taux de protéines Drp1 après traitement par le SFN (Fig. 1C et 3A).), et a donc conclu que le SFN ne modifiait pas la stabilité ou l’expression de Drp1, ce qui concorde avec le fait que Drp1 ait une demi-vie de> 10 h [50] et nos traitements de SFN étant de plus courte durée. Ensuite, nous avons examiné si la PNS avait une incidence sur le recrutement ou la rétention de Drp1 dans les mitochondries. Les études de fractionnement ont montré que le SFN induisait une perte de Drp1 de la fraction mitochondriale (Fig. 3A, pistes 7 – 8 et Fig. 3B). Comme indiqué précédemment [43], seule une fraction mineure de Drp1 (~ 3%) est associée au réseau mitochondrial à un moment donné pendant régime permanent conditions avec la plupart de l'enzyme résidant dans le cytoplasme (Fig. 3A, pistes 5 – 8). Ces données de fractionnement ont été confirmées par une analyse de co-localisation qui a montré une réduction de ~ 40% des foyers Drp1 localisés au niveau de la mitochondrie après le traitement par le SFN (Fig. 3C et D). Ensemble, ces données indiquent que la fusion mitochondriale induite par le SFN est due, du moins en partie, à l'association atténuée de Drp1 avec les mitochondries. Nos données ne font pas la distinction entre l'interférence du SFN avec le recrutement mitochondrial et la rétention mitochondriale de Drp1, ou les deux, l'analyse de Drp1 endogène ne permettant pas de visualiser la GTPase par microscopie à cellules vivantes.

La figure 3 SFN provoque une perte de Drp1 des mitochondries. (A) Fractionnement subcellulaire des cellules RPE-1 après 4 h du DMSO ou du SFN. Les lysats de cellules entières (WCL), les fractions nucléaires (Nuc), cytosoliques (Cyto) et mitochondriales brutes (Mito) ont été résolues par SDS-PAGE et traitées pour un Western blot avec les anticorps indiqués. La migration des marqueurs de poids moléculaire est indiquée à gauche. (B) Graphiques montrant la quantification densitométrique de Drp1 dans les fractions indiquées de (A). (C) Des cellules RPE-1 ont été transfectées avec 10 nM siCON ou siDrp1 et 3 quelques jours plus tard, traitées avec DMSO ou SFN pour 4 h. Drp1 (vert) a été visualisé avec un anticorps anti-Drp1, les mitochondries avec MitoTracker (rouge) et les noyaux avec DAPI (bleu). (D) Analyse automatisée de co-localisation du signal Drp1 et MitoTracker de (C). Les données entre (B) et (D) ont été compilées à partir d'expériences indépendantes de 3 et de 5, respectivement, et la signification statistique a été déterminée par le test t de Student bilatéral. Les barres d'erreur indiquent +/- SD et les astérisques indiquent la signification statistique. (Pour l'interprétation des références à la couleur dans cette légende, le lecteur est invité à consulter la version Web de cet article).

Sulforaphane confère une protection contre l'apoptose induite par la staurosportine, indépendante de Nrf2

Des travaux antérieurs ont montré que la fission mitochondriale est permissive dans la formation de pores dans la membrane mitochondriale externe générée par Bax / Bak pendant l'apoptose [11]. Drp1 s'est avéré sélectivement recruté dans les mitochondries au cours de l'apoptose [11] et, conformément à cela, des mitochondries fragmentées ont été observées au début du processus [27]. Inversement, on pense que l'inhibition de la fission mitochondriale inhibe l'apoptose en bloquant la formation des pores de la membrane externe qui permettent la libération du cytochrome c [53]. En conséquence, la stimulation de la fusion mitochondriale retarde la progression de l'apoptose induite par des composés comprenant la staurosporine (STS) [14]. Pour déterminer si le SFN protège les cellules RPE-1 de l'apoptose induite par STS et, dans l'affirmative, si cela nécessite Nrf2, nous avons établi un test permettant d'induire facilement le clivage de la poly ADP ribose polymérase (PARP), un substrat de caspase-3 activée et définitive marqueur de l'apoptose. Le traitement des cellules RPE-1 avec 1 µM ​​STS pour 6 h n'a provoqué qu'un clivage très modeste de la PARP, mais cela a été évité par un traitement en parallèle avec le SFN (par exemple, Fig. 4A, piste 3 versus 4). Pour augmenter la robustesse de ce test, nous avons sensibilisé davantage les cellules à l'apoptose induite par STS en les prétraitant avec un ARNsi ciblant le facteur anti-apoptotique, Bcl-XL. Ce prétraitement a réduit l'expression de Bcl-XL et le clivage de PARP fortement favorisé en fonction du temps d'exposition aux STS (Fig. 4B, comparer la voie 2 aux voies 4 – 10). Il est important de noter que 2 h du prétraitement avec le SFN a atténué le clivage de PARP dans les cellules exposées au STS (Fig. 4C, voie 3 versus 4 et piste 5 contre 6). De même, les cellules épuisées de manière stable en Nrf2 par CRISPR / Cas9 étaient comparativement protégées de la toxicité du STS par le prétraitement du SFN (Fig. 4C, voie 11 versus 12 et piste 13 versus 14 et Fig. 4D). Cette protection a été observée en utilisant à la fois le clivage PARP (Fig. 4C et D) et la morphologie cellulaire (Fig. 4E). L'efficacité de l'épuisement de Nrf2 par CRISPR / Cas9 a été confirmée par Western blot (Fig. 4C, Nrf2 blot). Comme prévu, les cellules en diminution de Drp1, qui produisent également un phénotype d'hyperfusion (Fig. 1A), ont également bloqué le clivage du PARP en réponse au STS par rapport aux cellules témoins incubées avec du SFN (Fig. 4F et G). Ensemble, ces résultats sont cohérents avec le fait que le RSF confère une protection contre l'apoptose grâce à sa capacité à limiter la fonction de Drp1, indépendamment de la stabilisation et de l'activation de Nrf2.

Figure 4 Les effets cytoprotecteurs du SFN sont indépendants de l'expression de Nrf2 (A) Les cellules RPE-1 ont été prétraitées au DMSO ou au 50 µM ​​SFN pour le 2 h avant le traitement au DMSO, au 1 μM staurosporine (STS) ou au 50 μM etoposide pour traitement 6 h et ont été traités pour le Western blot anti-PARP. (B) Des cellules RPE-1 ont été transfectées avec 2.5 nM siCON, 1 nM siBcl-XL ou 2.5 nM siBcl-XL et 3 quelques jours plus tard ont été traitées avec DMSO ou 1 μM STS pour 2, 4 ou 6 h. Des Western Blots représentatifs sont montrés et la migration des marqueurs de poids moléculaire est indiquée à gauche. (C) Les cellules knock-out de type sauvage (Nrf9WT) et Nrf2 (Nrf2KO) générées par CRISPR / Cas2 ont été pré-traitées avec du 1 nM siBcl-XL et 1 plus tard, avec des traitements DXO ou 3 supplémentaires. Ensuite, les cellules ont été traitées avec 50 µM ​​STS pour 2, 1 ou 2 h. Des transferts Western représentatifs avec les anticorps indiqués sont présentés. (D) Quantification de PARP clivé en pourcentage du total de PARP (clivé / non clivé) provenant d'expériences indépendantes de 4. Il est important de noter que les niveaux de PARP clivés étaient comparables, que les cellules expriment Nrf6 ou non, indiquant que la protection du SFN vis-à-vis du STS est indépendante du facteur de transcription. (E) Images à contraste de phase 3X prises immédiatement avant la récolte des lysats de (C). Barre d'échelle = 2 µm. (F) Des Western blots représentatifs démontrant que l'épuisement de Drp20 confère une protection presque comparable contre le STS par rapport au traitement par le PNS. Les cellules RPE-65 ont été transfectées avec 1 nM siBcl-XL et en outre transfectées avec 1 nM siCON ou 1 nM siDrp10. 10 jours plus tard, les cellules siCON ont été prétraitées avec du SFN comme dans (A) et (C), puis exposées à STS pendant 1 h avant d'être récoltées et traitées pour un western blot avec les anticorps indiqués. (G) Identique à (D) pour les données présentées dans (F) compilées à partir d'expériences indépendantes 3. Les barres d'erreur indiquent +/- SEM

Discussion

Nous avons découvert que le SFN module la dynamique de fission / fusion mitochondriale indépendamment de ses effets sur la voie KEAP1-Nrf2-ARE. Ceci est intriguant en raison d'un lien supposé entre le dysfonctionnement mitochondrial et la production de ROS et la nécessité de supprimer les radicaux libres dérivés des mitochondries par l'activation de Nrf2. Cet impact fonctionnel supplémentaire du SFN est potentiellement important, étant donné les nombreux essais cliniques actuellement menés sur 30 dans le traitement du SFN pour le traitement de diverses maladies, notamment le cancer de la prostate, la maladie pulmonaire obstructive et la drépanocytose [7], [10], [ 47].

Parce que SFN est un isothiocyanate [56] et qu'il active la signalisation Nrf2 en acylant directement les cystéines KEAP1 critiques pour supprimer la dégradation de Nrf2 [21], il s'ensuit que SFN exerce ses effets pro-fusion en modulant l'activité d'un facteur de fission ou de fusion via la modification de la cystéine . Nos données suggèrent fortement que Drp1 est régulé négativement par le SFN bien que la question de savoir si la GTPase est une cible directe de l'acylation reste à élucider. En dépit de cette lacune dans les connaissances, les fonctions du Drp1 sont clairement compromises par le RSF, car les mitochondries et les peroxysomes deviennent hyperfusé en réponse au traitement SFN et ces organites partagent Drp1 pour leurs événements de scission respectifs [38]. De plus, le SFN diminue la quantité de Drp1 qui se localise et s’accumule au niveau des mitochondries (Fig. 3). Étant donné que nos expériences ont été effectuées avec toutes les protéines endogènes, notre détection de Drp1 au niveau des sites de fission mitochondriale se fait dans des conditions d’état d’équilibre. Par conséquent, nous ne pouvons pas distinguer entre un recrutement et un défaut de rétention de l’enzyme causé par le PNS. De plus, nous ne pouvons pas éliminer la possibilité que SFN acylera un récepteur au niveau de la mitochondrie (Fis1 ou Mff) pour bloquer le recrutement de Drp1, mais nous soupçonnons que Drp1 est directement modifié. Drp1 possède neuf cystéines, dont huit résident dans le domaine intermédiaire requis pour l’oligomérisation [3] et l’autre dans le domaine de la GTPase effecteur (GED) au niveau de l’extrémité C de Drp1. L'acylation directe de l'une de ces cystéines pourrait provoquer un défaut d'activité dans Drp1 et donc sous-tendre l'effet du PNS sur la dynamique mitochondriale. Des travaux antérieurs suggèrent notamment que des défauts d'oligomérisation et d'activité catalytique peuvent abolir la rétention de Drp1 au niveau de la mitochondrie [52]. Cys644 dans le domaine GED est une cible particulièrement attractive basée sur des travaux antérieurs montrant que les mutations de cette cystéine phénocopie mutations qui altèrent l’activité de la Drp1 GTPase [4] et que cette cystéine particulière est modifiée par des électrophiles réactifs au thiol [9]. La résolution de cette question en suspens nécessitera une validation par spectrométrie de masse.Dans En résumé, nous avons identifié une nouvelle fonction cytoprotectrice pour le composé SFN cliniquement pertinent. En plus d'activer le principal facteur de transcription anti-oxydant Nrf2, le SFN favorise la fusion mitochondriale et peroxysomale, et cet effet est indépendant de Nrf2. Le mécanisme sous-jacent à ce phénomène implique une réduction de la fonction de la GTPase Drp1, le principal médiateur de la fission mitochondriale et peroxysomale. Une conséquence majeure de la fusion mitochondriale médiée par le SFN est que les cellules deviennent résistantes aux effets toxiques de la staurosporine, inducteur de l'apoptose. Cette action cytoprotectrice supplémentaire du SFN pourrait être d'une utilité clinique particulière dans les nombreuses maladies neurodégénératives pour lesquelles l'âge est le principal facteur de risque (par exemple, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la dégénérescence maculaire liée à l'âge) car ces maladies ont été associées à l'apoptose et réduites niveaux et / ou dérégulation de Nrf2 [35], [36], [48]. Ensemble, ces données démontrent que les propriétés cytoprotectrices du SFN s'étendent au-delà de l'activation du système KEAP1-Nrf2-ARE et justifient d'autres études étant donné l'utilisation actuelle de cet agent dans de multiples essais cliniques..

Matériaux et Mméthodes

Essais d'apoptose

Les cellules ont été ensemencées et transfectées avec du siRNA comme indiqué ci-dessous. Les cellules ont été prétraitées avec 50 µM ​​sulforaphane pour 2 h afin d'induire la fusion mitochondriale, puis ont été traitées avec 1 µM ​​staurosporine pour induire l'apoptose. Au moment de la récolte, les milieux ont été recueillis dans des tubes individuels et soumis à une centrifugation à grande vitesse pour sédimenter les cellules apoptotiques. Ce culot cellulaire a été combiné avec des cellules adhérentes et solubilisé dans un tampon Laemmli à temps concentré 2. Les échantillons ont été soumis à un Western Blot anti-PARP.

Génération de construction CRISPR / Cas9

Pour créer LentiCRISPR / eCas9 1.1, LentiCRISPR v2 (addgene #52961) a d'abord été coupé avec Age1 et BamH1. Ensuite, SpCas9 de eSpCas9 1.1 (addgene #71814) a été amplifié avec Age1 et BamH1, Les séquences d'ARNg ont été déterminées à l'aide de Benchling.com. Les paramètres ont été définis pour cibler la séquence de codage avec les scores les plus élevés et les plus faibles hors cible. Les séquences suivantes (séquences de ciblage soulignés, hs sgNFE2L2 # 1 sens CACCGCGACGGAAAGAGTATGAGC, antisens AAACGCTCATACTCTTTCCGTCGC; hs sgNFE2L2 # 2 CACCGGTTTCTGACTGGATGTGCT sens, AAACAGCACATCCAGTCAGAAACC antisens; hs sgNFE2L2 # 3 sens CACCGGAGTAGTTGGCAGATCCAC, AAACGTGGATCTGCCAACTACTCC antisens) ont été annelés et ligaturés dans BsmB1 coupé LentiCRISPR / eCas9 1.1. Les cellules RPE-1 infectées par la lentille ont été sélectionnées avec de la puromycine et maintenues dans une population en pool. Le knockout a été confirmé par immunofluorescence et Western blot.

Culture cellulaire et transfections

Des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines transformées avec la télomérase (RPE-1) (ATCC) ont été cultivées dans du milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 1 g / L glucose additionné de pénicilline, streptomycine, cocktail d'acides aminés non essentiel 1X (Life Technologies), et 10% sérum fœtal bovin (Life Technologies). Pour les transfections d'ARNsi, les cellules 30,000 – 35,000 / mL ont été ensemencées pendant la nuit. Les cellules ont reçu le siRNA 10 nM dilué dans du DMEM sans sérum et combiné avec le réactif de transfection 0.3% interférine (PolyPlus). Pour la sensibilisation à l'apoptose, les cellules ont reçu un siARN 1 nM Bcl-XL. Les cellules ont été récoltées 2 – 3 quelques jours après la transfection.

Produits chimiques, anticorps et siRNA Oligos

Anticorps dirigés contre l'α-tubuline (signalisation cellulaire), la β-tubuline (Sigma), Drp1 (BD Biosciences), KEAP1 (Proteintech), Lamin B1 (Abcam), PARP (signalisation cellulaire), PMP70 (Abcam) et Tom20 (BD Biosciences) ) ont été utilisés à des dilutions 1: 1000 pour le transfert Western et l’immunofluorescence. Un anticorps interne anti-Nrf2 de lapin a été utilisé à 1: 2000 pour le Western blotting [34], [59]. Le sulforaphane (Sigma) et la staurosporine (Tocris) ont été utilisés à 50 µM ​​et 1 µM ​​respectivement. Des siRNAs contre Drp1 (Dharmacon), Nrf2 (Dharmacon), KEAP1 (signalisation cellulaire) et Bcl-XL (signalisation cellulaire) ont été utilisés à 10 nM, sauf indication contraire.

Immunofluorescence et marquage in vivo

Les cellules ensemencées sur des lamelles de verre 18 mm ont été traitées avec un véhicule ou un médicament, fixées dans du 3.7% formaldéhyde puis perméabilisées dans du 0.2% Triton X-100 / PBS sur de la glace pendant 10 min. Les anticorps primaires ont été incubés dans 3% de sérum albumine bovine (BSA) dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C. Après les lavages avec du PBS, les cellules ont été incubées pendant 1 h dans des anticorps secondaires conjugués Alexa 488 ou Alexa546 appropriés (1 dilué: 1000) et 0.1 μg / mL DAPI (Sigma) dans 3% BSA / PBS. Les mitochondries ont été visualisées soit par immunofluorescence anti-Tom20, soit par incubation de cellules dans du CMXRos 200 nM MitoTracker Red (Molecular Probes, Inc.) sans sérum pour 30 min à 37 ° C avant fixation.

Microscopie et analyse d'images

Les échantillons d'immunofluorescence ont été visualisés sur un microscope confocal LSM710 (Carl Zeiss). Les micrographies ont été capturées à l'aide d'objectifs d'immersion dans l'huile 63X ou 100X et les images ont été ajustées et améliorées à l'aide d'Adobe Photoshop CS6. L'analyse de co-localisation a été réalisée à l'aide de la fonctionnalité de co-localisation Carl Zeiss LSM710 avec des seuils définis manuellement tout en étant masquée quant à l'identité des échantillons. Les barres d'échelle partout, sauf indication contraire, sont 10 µm. La morphologie mitochondriale a été évaluée par un score en aveugle. Si les mitochondries d'une cellule étaient maintenues comme multiples, arrondies, discriminantes, la cellule était notée comme 'fission'. Si les mitochondries individuelles étaient impossibles à distinguer et que tout le réseau mitochondrial semblait continu, la cellule était notée «fusion». Toutes les autres cellules, y compris celles avec des mitochondries en cluster, ont été marquées comme "intermédiaires".

Fractionnements subcellulaires

Les cellules RPE-1 ont été cultivées jusqu'à confluence. Après un lavage au PBS, les cellules ont été soumises à une centrifugation à 600 × g pendant 10 min et remises en suspension dans du tampon d’isolement 600 μL (210 mM Mannitol, 70 mM Sucrose, 5 mM MOPS, 1 mM EDTA pH 7.4 mM XMUM PMSF). La suspension a été lysée fois 1 dans un homogénéisateur Dounce. Une fraction de l'homogénat a été conservée sous forme de «lysat de cellules entières». Le reste a été soumis à une centrifugation à 30 × g pendant 800 min pour sédimenter les noyaux. Les surnageants ont été soumis à une centrifugation à 10 × g pendant 1500 min pour éliminer les noyaux restants et les cellules non lysées. Ce surnageant a été soumis à une centrifugation à 10 × g pendant 15,000 min pour sédimenter les mitochondries. Le surnageant a été conservé en tant que «fraction cytosolique». Le culot a été lavé doucement avec du PBS et remis en suspension dans un tampon d'isolement. La concentration en protéines de chaque fraction a été mesurée par dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) et les quantités équivalentes de protéines ont été résolues par SDS-PAGE.

Western Blot

Les cellules ont été lavées dans du PBS et solubilisées dans du tampon de solubilisation Laemmli fois concentré 2 fois (100 mM Tris [pH 6.8], 2% SDS, 0.008% bleu de bromophénol, 2% 2-mercaptoéthanol, 26.3% de glycérol et 0.001. Pyrinin Y). Les lysats ont été bouillis pendant 5 min avant le chargement sur des gels de Polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS). Les protéines ont été transférées sur des membranes de nitrocellulose et bloquées pendant 1 h dans 5% Milk / TBST. Les anticorps primaires ont été dilués dans 5% Lait / TBST et incubés avec le transfert pendant une nuit à 4 ° C. Les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) ont été dilués dans 5% Lait / TBST. Les transferts ont été traités avec une chimioluminescence améliorée et des quantifications densitométriques ont été effectuées à l'aide du logiciel ImageJ.

Dr Jimenez White Coat

Le sulforaphane est un produit chimique de la collection d'isothiocyanates de substances organosulfurées provenant de légumes crucifères, notamment le brocoli, le chou, le chou-fleur, le chou frisé et le chou vert, entre autres. Le sulforaphane est produit lorsque l’enzyme myrosinase transforme la glucoraphanine, un glucosinolate, en sulforaphane, également appelé sulforaphane-glucosinolate. Les pousses de brocoli et le chou-fleur ont la plus forte concentration de glucoraphanine ou le précurseur du sulforaphane. Des études ont démontré que le sulforaphane améliore les capacités antioxydantes du corps humain afin de prévenir divers problèmes de santé.

Dr. Alex Jimenez DC, CCST Insight

Le sulforaphane et ses effets sur le cancer, la mortalité, le vieillissement, le cerveau et le comportement, les maladies cardiaques, etc.

Les isothiocyanates sont parmi les composés végétaux les plus importants de votre alimentation. Dans ce vidéo Je leur présente le dossier le plus complet qui ait jamais été présenté. Capacité d'attention limittée? Passez à votre sujet préféré en cliquant sur l'un des points temporels ci-dessous. Pension Complète calendrier ci-dessous.

Sections clés:

  • 00: 01: 14 - Cancer et mortalité
  • 00: 19: 04 - Vieillissement
  • 00: 26: 30 - Cerveau et comportement
  • 00: 38: 06 - Récapitulatif final
  • 00: 40: 27 - Dose

Chronologie complète:

  • 00: 00: 34 - Introduction du sulforaphane, un axe majeur de la vidéo.
  • 00: 01: 14 - Consommation de légumes crucifères et réduction de la mortalité toutes causes confondues.
  • 00: 02: 12 - Risque de cancer de la prostate.
  • 00: 02: 23 - Risque de cancer de la vessie.
  • 00: 02: 34 - Risque de cancer du poumon chez les fumeurs.
  • 00: 02: 48 - Risque de cancer du sein.
  • 00: 03: 13 - Hypothétique: et si vous avez déjà un cancer? (interventionnel)
  • 00:03:35 - Conduite de mécanisme plausible le cancer et données associatives sur la mortalité.
  • 00: 04: 38 - Sulforaphane et cancer.
  • 00:05:32 - Preuve animale montrant fort effet de l'extrait de brocoli sur le développement des tumeurs de la vessie chez le rat
  • 00: 06: 06 - Effet de la supplémentation directe en sulforaphane chez les patients atteints d'un cancer de la prostate.
  • 00: 07: 09 - Bioaccumulation de métabolites de l’isothiocyanate dans les tissus mammaires réels.
  • 00: 08: 32 - Inhibition des cellules souches du cancer du sein.
  • 00: 08: 53 - Leçon d'histoire: les brassicas ont été reconnus comme ayant des propriétés bénéfiques pour la santé, même dans la Rome antique.
  • 00: 09: 16 - Capacité du sulforaphane à améliorer l’excrétion des substances cancérogènes (benzène, acroléine).
  • 00: 09: 51 - NRF2 en tant que commutateur génétique via des éléments de réponse antioxydante.
  • 00: 10: 10 - Comment l'activation de NRF2 améliore l'excrétion des cancérogènes via le glutathion-S-conjugué.
  • 00: 10: 34 - Les choux de Bruxelles augmentent la glutathion-S-transférase et réduisent les dommages causés à l'ADN.
  • 00: 11: 20 - La boisson de germes de brocoli augmente l'excrétion de benzène de 61%.
  • 00: 13: 31 - L’homogénat de germe de brocoli augmente les enzymes antioxydantes dans les voies respiratoires supérieures.
  • 00: 15: 45 - Consommation de légumes crucifères et mortalité par maladie cardiaque.
  • 00: 16: 55 - La poudre de germe de brocoli améliore les lipides sanguins et le risque global de maladie cardiaque chez les diabétiques de type 2.
  • 00:19:04 - Début de vieillissement .
  • 00:19:21 - Le régime enrichi en sulforaphane améliore durée de vie des coléoptères de 15 à 30% (dans certaines conditions).
  • 00: 20: 34 - Importance de la faible inflammation pour la longévité.
  • 00: 22: 05 - Les légumes crucifères et la poudre de germe de brocoli semblent réduire une grande variété de marqueurs inflammatoires chez l'homme.
  • 00: 23: 40 - Récapitulatif de vidéos: cancer, sections vieillissantes
  • 00: 24: 14 - Des études chez la souris indiquent que le sulforaphane pourrait améliorer la fonction immunitaire adaptative chez les personnes âgées.
  • 00:25:18 - Le sulforaphane a amélioré la croissance des poils chez un modèle murin de calvitie. Image à 00: 26: 10.
  • 00: 26: 30 - Début de la section sur le cerveau et le comportement.
  • 00: 27: 18 - Effet de l'extrait de germe de brocoli sur l'autisme.
  • 00: 27: 48 - Effet de la glucoraphanine sur la schizophrénie.
  • 00: 28: 17 - Début de discussion sur la dépression (mécanisme plausible et études).
  • 00:31:21 - Une étude sur la souris utilisant 10 modèles différents de dépression induite par le stress montre que le sulforaphane est aussi efficace que la fluoxétine (prozac).
  • 00: 32: 00 - Une étude a montré que l'ingestion directe de glucoraphanine chez la souris était également efficace pour prévenir la dépression due au modèle de stress lié à la défaite sociale.
  • 00: 33: 01 - Début de la section sur la neurodégénérescence.
  • 00: 33: 30 - Sulforaphane et la maladie d'Alzheimer.
  • 00: 33: 44 - Sulforaphane et maladie de Parkinson.
  • 00: 33: 51 - Maladie de Sulforaphane et de Hungtington.
  • 00: 34: 13 - Sulforaphane augmente les protéines de choc thermique.
  • 00: 34: 43 - Début de la section sur les lésions cérébrales traumatiques.
  • 00: 35: 01 - Sulforaphane injecté immédiatement après que TBI améliore la mémoire (étude chez la souris).
  • 00: 35: 55 - Plasticité neuronale et sulforaphane.
  • 00:36:32 - Sulforaphane améliore l'apprentissage en modèle du diabète de type II chez la souris.
  • 00:37:19 - Sulforaphane et duchenne dystrophie musculaire.
  • 00: 37: 44 - Inhibition de la myostatine dans les cellules satellites musculaires (in vitro).
  • 00: 38: 06 - Récapitulatif vidéo tardif: mortalité et cancer, dommages à l'ADN, stress oxydatif et inflammation, excrétion de benzène, maladie cardiovasculaire, diabète de type II, effets sur le cerveau (dépression, autisme, schizophrénie, neurodégénérescence), voie NRF2.
  • 00: 40: 27 - Envisagez de trouver une dose de germes de brocoli ou de sulforaphane.
  • 00: 41: 01 - Anecdotes sur la germination à la maison.
  • 00: 43: 14 - Températures de cuisson et activité du sulforaphane.
  • 00: 43: 45 - Conversion du sulforaphane à partir de glucoraphanine par des bactéries intestinales.
  • 00: 44: 24 - Les suppléments fonctionnent mieux lorsqu'ils sont combinés avec une myrosinase active provenant de légumes.
  • 00: 44: 56 - Techniques de cuisson et légumes crucifères.
  • 00: 46: 06 - Isothiocyanates en tant que goitrogènes.

Remerciements

Sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231716302750

Comment produit-on le sulforaphane?

Le chauffage diminue l'activité des protéines de l'épithiospécifiant et augmente la formation de sulforaphane chez le brocoli

Abstrait

Le sulforaphane, un isothiocyanate de brocoli, est l’un des anticarcinogènes les plus puissants dérivés des aliments. Ce composé n'est pas présent dans le légume intact, mais est formé à partir de son précurseur du glucosinolate, la glucoraphanine, par l'action de la myrosinase, une enzyme de la thioglucosidase, lorsque le tissu du brocoli est broyé ou mâché. Cependant, un certain nombre d’études ont démontré que le rendement en sulforaphane de la glucoraphanine est faible, et qu'un analogue de nitrile non bioactif, le sulforaphane nitrile, est le principal produit d'hydrolyse lorsque le tissu végétal est broyé à la température ambiante. Des preuves récentes suggèrent que chez Arabidopsis, la formation de nitrile à partir de glucosinolates est contrôlée par une protéine thermosensible, épithiospécifiant protéine (ESP), un cofacteur non catalytique de la myrosinase. Nos objectifs étaient d’examiner les effets du réchauffement des bouquets de brocoli et de germes sur la formation de sulforaphane et de sulforaphane nitrile, de déterminer si le brocoli contient une activité ESP, puis de corréler les variations thermodépendantes de l’activité ESP, de la teneur en sulforaphane et de la bioactivité mesurées par induction enzyme de détoxification de phase II, quinone réductase (QR) en culture cellulaire. Le chauffage des fleurons de brocoli ou des pousses de brocoli frais à 60 ° C avant l'homogénéisation augmentait simultanément la formation de sulforaphane et diminuait la formation de sulforaphane nitrile. Une perte significative d'activité de l'ESP a été parallèle à la diminution de la formation de sulforaphane nitrile. Le chauffage à 70 ° C et au-dessus a diminué la formation des deux produits chez les bouquets de brocoli, mais pas chez les pousses de brocoli. L'induction de QR dans des cellules de hépatome de souris cultivées Hepa lclc7 a été parallèle à une augmentation de la formation de sulforaphane.

Le préchauffage des fleurs de brocoli et des choux à 60 ° C a considérablement augmenté la formation de sulforaphane (SF) catalysée par la myrosinase dans les extraits de tissus végétaux après le broyage. Ceci était associé à une diminution de la formation de sulforaphane nitrile (SF Nitrile) et de l'activité de la protéine épithiospécifiante (ESP).

Mots clés: Brocoli, Brassica oleracea, Cruciferae, Cancer, Anticarcinogène, Sulforaphane, Sulforaphane nitrile, Protéine de l'épithiospécifiant, Quinone réductase

En conclusion, le sulforaphane est un phytochimique présent dans brocoli,et autres légumes crucifères. Une quantité incontrôlée d'oxydants causée par des facteurs internes et externes peut provoquer un stress oxydatif dans le corps humain, ce qui peut finalement entraîner divers problèmes de santé. Le sulforaphane peut activer la production de Nrf2, un facteur de transcription qui aide à réguler les mécanismes antioxydants protecteurs qui contrôlent la réponse de la cellule aux oxydants. La portée de nos informations est limitée aux problèmes de chiropratique et de santé de la colonne vertébrale. Pour discuter du sujet, n'hésitez pas à demander au Dr Jimenez ou à nous contacter à 915-850-0900 .

Organisé par le Dr. Alex Jimenez

Référencé de: Sciencedirect.com

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Sujet de discussion supplémentaire: maux de dos aigus

Mal au dos est l'une des causes les plus courantes d'invalidité et de jours de travail manqués dans le monde. Les maux de dos sont la deuxième cause la plus fréquente de consultation chez le médecin, en plus des infections respiratoires supérieures. Environ 80 pour cent de la population souffrira de douleurs au dos au moins une fois au cours de sa vie. La colonne vertébrale est une structure complexe composée d'os, d'articulations, de ligaments et de muscles, entre autres tissus mous. Pour cette raison, des blessures et / ou des conditions aggravées, telles que hernies discales, peut éventuellement conduire à des symptômes de maux de dos. Les blessures sportives ou les accidents d'automobile sont souvent la cause la plus fréquente de maux de dos. Cependant, les mouvements les plus simples peuvent parfois avoir des conséquences douloureuses. Heureusement, les options de traitement alternatives, telles que les soins chiropratiques, peuvent aider à soulager les maux de dos grâce à l'utilisation des ajustements de la colonne vertébrale et des manipulations manuelles, en fin de compte améliorer le soulagement de la douleur.

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